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首先說說什么是單細胞測序（Single-cell sequencing）。普通測序所提取的RNA（或DNA）源于樣本中的多個細胞，所以普通測序的結(jié)果不可避免的會受到不同細胞間異質(zhì)性（Heterogeneity）的影響，而單細胞測序則是針對單個細胞的基因組進行測序，能夠更好地幫助我們認識細胞與細胞之間的差異。

肯定有童鞋要問了，一個細胞里的DNA或RNA僅僅處在皮克（Picograms）級的水平，這么少的量遠遠達不到現(xiàn)有測序儀的最低上樣需求，那么單細胞測序要怎么搞？這就不得不提到全基因組擴增（Whole-genome amplification，WGA）這項技術(shù)了，這項技術(shù)顧名思義，就是對全基因組進行擴增，目前主流上有三類方法（見下圖）。

PCR為基礎(chǔ)的擴增方法，在擴增的時候?qū)σ恍┨厥馕稽c可能會存在偏好，導致對整個基因組的覆蓋程度不夠。

以MDA（Multiple displacement amplification）為代表的等溫法雖然對基因組的覆蓋程度較好，但是一致性（Uniformity）較差。

而以謝曉亮（Sunney Xie）教授研發(fā)的多重退火和成環(huán)循環(huán)擴增技術(shù)（Multiple Annealing and Looping-Based Amplification Cycles, MALBAC）為代表的混合法，在基因組的覆蓋程度和一致性上相比于前兩種方法處于中等。

從全基因組擴增這一步來看，擴增帶來的誤差會對全基因組測序的精度造成極大的影響。而實際上單細胞測序技術(shù)上的挑戰(zhàn)遠遠不僅于此。從第一步細胞分離開始，就需要極高的實驗操作水準，特別是在面對復雜的固狀組織時，標準的protocol固然能幫上很大的忙，但是細致的操作和實操經(jīng)驗更為重要。而擴增之后，在基因組中如何選定合適的研究范圍對于降低成本和提高效率至關(guān)重要。

正是由于單細胞測序所要面臨的重重困難，在2013年以前，單細胞測序技術(shù)在全世界范圍內(nèi)只有極少數(shù)頂尖的實驗室才有應用。2013年的時候，F(xiàn)luidigm公司推出了世界上第一款單細胞RNA測序自動化準備系統(tǒng)（Single-cell automated prep system for RNA-seq），這一技術(shù)上的突破使得單細胞測序變得足夠簡單，成本也降低了很多，這才使得單細胞測序能夠普及開來。同年，單細胞測序技術(shù)榮膺Nature Methods的年度技術(shù)。所以說，單細胞測序技術(shù)雖難，但是童鞋們現(xiàn)在上車并不算晚，車才剛開沒一會。

下面說說我們到底為什么要做單細胞測序，單細胞測序到底有哪些應用？

前面已經(jīng)提到，同一組織中的細胞間都是存在異質(zhì)性的，更不必提不同組織、不同系統(tǒng)中細胞的異質(zhì)性了。這一異質(zhì)性，會影響我們對細胞基因功能認知的準確性。單細胞測序能夠幫助我們了解那些難以培養(yǎng)的微生物的基因組功能、了解遺傳鑲嵌功能（Genetic mosaicism）在普通生物學功能或是疾病發(fā)生中的作用、了解腫瘤內(nèi)在異質(zhì)性對腫瘤發(fā)展以及耐藥性的影響、重新定義細胞亞型等等。

左為在單細胞生物中的應用，單細胞測序可以幫助我們搜尋稀有（基因組）微生物；右為在多細胞生物中的應用 ，單細胞測序可以幫助我們尋找罕見突變，從而了解基因突變和進化的信息和其對應的生物學功能。

最后再給大家分享兩個具體的單細胞測序的應用實例：

1、Single-CellResolutionof TemporalGeneExpressionduring HeartDevelopment （Dev Cell. 2016 Nov 21）

在子宮內(nèi)，心臟最開始是一根管，然后是芽珠狀的硬塊，再通過自動折疊，最終變成了我們熟知的四腔結(jié)構(gòu)，那么究竟細胞是如何一步一步進行上述程序化的操作的呢？

心臟結(jié)構(gòu)形成過程

該文作者從小鼠胚胎發(fā)育的七個不同階段提取心臟細胞樣本，他們將細胞分為三類已知的細胞——心肌細胞、內(nèi)皮細胞和成纖維細胞，并觀察它們的基因活性隨時間是如何變化的；他們在小鼠模型中闡明了Nkx2.5雜合突變是如何導致先天性心臟缺陷的。心臟細胞發(fā)育圖譜的構(gòu)建有助于我們了解基因和細胞的變化是如何導致心臟結(jié)構(gòu)的變化的、基因突變是如何改變每一個細胞群成熟的方式以及心臟構(gòu)建過程中的重要步驟是什么。

2、Decoupling genetics, lineages, and microenvironment in IDH-mutant gliomas by single-cell RNA-seq （Science. 2017 Mar 31）

星形細胞瘤和少突膠質(zhì)細胞瘤都被認為是不治之癥，但手術(shù)和放療可明顯延長生存期。這兩種腫瘤被認為是由支持和保護神經(jīng)元的神經(jīng)膠質(zhì)細胞的亞型發(fā)育而來的，但在遺傳學、外觀和基因表達方面都有所不同。雖然這兩種類型的腫瘤都含有類似的神經(jīng)膠質(zhì)細胞，它們也都含有該細胞類型的標記，這就引起了人們對它們起源于不同類型細胞這一普遍看法的質(zhì)疑。

實驗流程

該文研究團隊對10例星形膠質(zhì)瘤樣本中的9800個細胞和6例少突膠質(zhì)瘤樣本中的4300個細胞進行了單細胞RNA測序。再結(jié)合癌癥基因組Atlas中的165例轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，研究人員發(fā)現(xiàn)，兩種腫瘤都含有3種癌癥細胞：非增殖性細胞、類神經(jīng)干細胞和祖細胞。其中的非增殖細胞被細分為星形膠質(zhì)細胞樣和少突膠質(zhì)細胞樣，利用單細胞測序技術(shù)，作者闡明了這兩種細胞具有相同的起源，其不同之處主要是遺傳學差異，以及腫瘤微環(huán)境（如特異性免疫細胞豐度等）組成不同。

在該研究中，作者觀察到即使在更晚期的腫瘤階段，越是分化的腫瘤細胞越不容易增殖，這意味著，如果可以促進腫瘤細胞分型，將會顯著地控制腫瘤生長。故而作者提出可以使用免疫療法攻擊特定的細胞類型，從而終止腫瘤的生長的治療策略。