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實(shí)體組織制備溫和組織處理器
行業(yè)新聞 2018-11-19
  流式細(xì)胞術(shù)作為一種可在單細(xì)胞水平上對大量細(xì)胞進(jìn)行快速、準(zhǔn)確、多參數(shù)定量分析和分選的高技術(shù),在細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)等方面的應(yīng)用日趨廣泛和深入。進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析的前提是樣品為單細(xì)胞懸液,根據(jù)不同實(shí)體組織成分的特點(diǎn)可選擇不同的分散細(xì)胞的方法,以期達(dá)到單細(xì)胞產(chǎn)量高、細(xì)胞損傷小的目的。

       在實(shí)體組織分散為單細(xì)胞的過程中,解離的方法有可能瞬間或持久地影響細(xì)胞的性質(zhì),比如,形態(tài)上顯而易見的細(xì)胞膜破損,細(xì)胞表面上可出現(xiàn)泡狀特征,還有一些是難以觀察到的線粒體活性的變化、選擇性膜表面抗原的丟失、蛋白質(zhì)的丟失等,細(xì)胞受損程度受溫度、pH值、處理時間等多種因素的影響。機(jī)械性或人工制備的單細(xì)胞,在某些性質(zhì)上很可能已改變了原組織細(xì)胞特性,因此處理不同組織時,努力摸索方法,盡可能采用對細(xì)胞損傷小,產(chǎn)率較高的單細(xì)胞懸液制備方法,最大限度地保持細(xì)胞原有特性。

       目前將組織分離為單個細(xì)胞的傳統(tǒng)方法有機(jī)械法、酶消化法和化學(xué)法等,這些方法沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn),且非常浪費(fèi)時間,獲得的細(xì)胞的活性和得率相對低很多,美天旎研發(fā)的gentleMACS組織處理系統(tǒng)結(jié)合機(jī)械法和酶消化法,使用自動化方式可以快速溫和、安全、省時、標(biāo)準(zhǔn)化、便捷、自動化的從組織(脾臟,肝臟,肺部,腫瘤,表皮,神經(jīng)組織....)中分離單個細(xì)胞懸液,也可將組織塊制備成勻漿(如蛋白提取,核酸提取)。下面介紹幾種
溫和組織處理器方法。

溫和組織處理器

  (一)酶消化法

  酶的作用原理主要有三方面:一是破壞組織間的膠原纖維、彈性纖維等,二是水解組織細(xì)胞的緊密連接結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì),三是水解組織粘多糖物質(zhì)。酶消化法是實(shí)體組織分散為單細(xì)胞的主要方法之一。常用的酶類有:胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、鏈霉蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、溶菌酶、彈性蛋白酶等??筛鶕?jù)分散的組織類型確定使用的酶類。需要注意的是使用條件和影響因素(酶濃度、酶效價、作用時間、pH值)等,如胃蛋白酶在堿性環(huán)境下失去活性,胰酶在中性溶液中活性欠佳。

  酶消化法常規(guī)程序如下:

  1、將適合于酶消化的組織置于離心管中。

  2、將選好的酶溶液1~2ml加入盛有被消化組織的試管中。

  3、常規(guī)消化20~30min(恒溫37℃或室溫),消化期間間斷振蕩或吹打。

  4、終止消化,收集細(xì)胞懸液,以300目尼龍網(wǎng)過濾,除去細(xì)胞,以低速離心除去細(xì)胞碎片。

  5、加入PBS 2ml充分混勻,離心棄掉上清。再加入0.5ml PBS重懸細(xì)胞。

  6、將制備好的單細(xì)胞懸液進(jìn)行熒光標(biāo)記后上機(jī)檢測或保存?zhèn)溆谩?/span>

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  (二)機(jī)械法

  機(jī)械法分散實(shí)體組織包括:用剪刀剪碎組織或用鋒利的解剖刀剁碎組織,用勻漿器勻漿,用線注射針頭反復(fù)抽吸細(xì)胞等,最后用300目尼龍網(wǎng)過濾細(xì)胞得到
溫和組織處理器。

  1、剪碎法

  (1)將組織塊放入平皿中,加入少量生理鹽水。

  (2)用剪刀將組織剪至勻漿狀。

  (3)加入10ml生理鹽水。

  (4)用吸管吸取組織勻漿,先以100目尼龍網(wǎng)過濾到試管內(nèi)。

  (5)離心沉淀1000rpm/min,4~5min,再用生理鹽水洗3次,每次以短時低速(500~800rpm/min)離心沉淀去除細(xì)胞碎片。

  (6)以300目尼龍網(wǎng)過濾去除細(xì)胞。

  (7)選擇適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ?70%冰乙醇等)固定細(xì)胞或低溫保存?zhèn)溆谩?br />
  2、網(wǎng)搓法

  (1)將100目、300目尼龍網(wǎng)扎在小燒杯上。

  (2)把剪碎的組織放在網(wǎng)上,用眼科鑷子輕輕搓組織塊,邊搓邊用生理鹽水沖洗,直到將組織搓完。

  (3)收集細(xì)胞懸液,離心沉淀細(xì)胞500~800rpm/min,2分鐘。

  (4)固定細(xì)胞或低溫保存?zhèn)溆?/span>溫和組織處理器。

  3、研磨法

  (1)先將組織剪碎成1~2mm3小塊。

  (2)放入組織研磨器中加入1~2ml生理鹽水。

  (3)轉(zhuǎn)動研棒,研至勻漿。

  (4)加入10ml生理鹽水,沖洗研磨器。

  (5)收集細(xì)胞懸液,并經(jīng)300目尼龍網(wǎng)過濾,離心沉淀細(xì)胞,500~800rpm/min,2分鐘,再用生理鹽水洗3遍,離心沉淀。

  (6)固定或低溫保存細(xì)胞,備用。


溫和組織處理器

  (三)化學(xué)處理法

  化學(xué)處理法的主要原理是:將組織細(xì)胞間起粘連作用的鈣、鎂離子置換出來,從而使細(xì)胞分散下來。

  1、
溫和組織處理器試劑配制

  (1)0.2%EDTA配制:將0.2gEDTA溶解于100ml Hank液中,封裝高壓消毒,置0~4℃保存。

  (2)胰酶加EDTA配制:胰酶0.25g加PBS(pH7.0)200ml,濃度為0.125%,EDTA0.2g加PBS(pH7.0)100ml,濃度為0.2%。各取40ml混合,分裝后置0~4℃冰箱保存,使用前過濾即可使用。

  2、實(shí)驗(yàn)方法

  (1)將組織切成薄片,置于試管。

  (2)首先加入EDTA液5ml,室溫下0.5小時,離心棄之。

  (3)加入胰酶-EDTA液5~10ml,置37℃恒溫水浴30min,間斷振蕩3~5次。

  (4)用300目尼龍網(wǎng)過濾,離心沉淀1000rpm/min,5分鐘。再以生理鹽水洗2~3次,離心500~800rpm,1~2分鐘。

  (5)將細(xì)胞固定或低溫保存?zhèn)溆?/span>溫和組織處理器。

  化學(xué)處理法獲得的細(xì)胞存活率低,細(xì)胞產(chǎn)量較低,細(xì)胞碎片和細(xì)胞聚集量不穩(wěn)定。


溫和組織處理器

  (四)美天旎組織解離系統(tǒng)

  1、使用方法:將20~4000mg大小樣本或0.3~10ml樣本與組織所對應(yīng)得解離試劑盒共同加入至組織解離管并旋緊管蓋;把解離管安裝至gentleMACS溫和組織處理器上,啟動程序并運(yùn)行,最終得到
溫和組織處理器或亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

  2、適用組織:

  (1) 制備
溫和組織處理器

  • 人類或小鼠的腫瘤組織

  • 小鼠或大鼠的新生心臟組織

  • 神經(jīng)組織

  • 小鼠的脾臟,肺,固有膜,肌肉,上皮組織,肝臟

  • 人類或小鼠的皮膚等

  (2)制備組織勻漿

  • 從新鮮或凍存樣本中提取DNA,RNA

  • 提取蛋白

  • 分離細(xì)胞器

  • 測定病原菌滴度等

  3、產(chǎn)品特點(diǎn)

  (1)溫和有效:

  gentleMACS使用專門的一次性分離管(C管和M管),管蓋上帶有特殊設(shè)計(jì)的轉(zhuǎn)子和定子,對樣本減少損傷,保證了細(xì)胞活性,同時得到了高回收率。

  (2)一個機(jī)器支持多種用途:

  生成
溫和組織處理器和制備亞細(xì)胞物質(zhì)。C管可以得到單細(xì)胞懸液,用于細(xì)胞分選,分析或者是培養(yǎng)。M管可以將組織和細(xì)胞勻漿,用于分離亞細(xì)胞物質(zhì)(如蛋白,核酸)。

  (3)無菌分離:

  C管和M管的中心都有一個用隔膜封閉的小孔,能保證在無菌條件下,在封閉系統(tǒng)中安全地處理樣品。

  (4)用戶安全:

  針對一些感染性樣本處理采用封閉系統(tǒng)處理,比如細(xì)菌病原感染的樣本,完全不需要打開試管蓋,即可添加酶以及其他溶液,或者取出分離出來的細(xì)胞或者勻漿溶液,保護(hù)實(shí)驗(yàn)室操作人員安全。

  (5)全自動和標(biāo)準(zhǔn)化:

  自動標(biāo)準(zhǔn)化程序已經(jīng)設(shè)置好時間,速度和操作方向,只要將樣本材料和適合的溶液(如緩沖液,培養(yǎng)基等等)加入試管內(nèi),把試管頭朝下安裝即可運(yùn)行程序。

  (6)結(jié)果可靠:

  標(biāo)準(zhǔn)化流程操作,減少人為操作誤差,使結(jié)果有高度可重復(fù)性。

  (7)便捷靈活:

  超凈臺上即可操作,方便安裝。儀器樣本容量靈活(0.3~10ml),標(biāo)本大小20~4000mg。

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