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　　1. 為什么要做單細(xì)胞RNA測序(ScRNA-seq)?

　　主要解決的問題主要有兩個：一是異質(zhì)性(heterogeneity)，比如a)鑒定某些因為含量(比例)較低而在常規(guī)RNA測序檢測時被“掩蓋”的細(xì)胞亞群;b) 檢測細(xì)胞群體中不同的個體細(xì)胞：比如表達(dá)不同TCR的T細(xì)胞，胚胎發(fā)育早期的各個細(xì)胞等;c)追蹤某群細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞間的譜系(lineage)或發(fā)育關(guān)系;二是獲得基因表達(dá)、剪接等信息以及根據(jù)這些信息構(gòu)建的調(diào)控關(guān)系。

　　2. 做單細(xì)胞測序的基本步驟是什么?

　　如上圖所示，共分為9個步驟：

　　1)單細(xì)胞分離;

　　2) 保留mRNA的細(xì)胞裂解;

　　3) mRNA捕獲;

　　4)RNA反轉(zhuǎn)成cDNA;

　　5)cDNA擴(kuò)增;

　　6)cDNA測序文庫制備;

　　7)序列文庫混樣(pooling);

　　8)生物信息學(xué)工具進(jìn)行質(zhì)控;

　　9)專業(yè)的工具進(jìn)行分析和結(jié)果展示;

　　3. 單細(xì)胞測序檢測的樣品類型有哪些?

　　理論上說，任何的真核細(xì)胞都可以進(jìn)行scRNA-seq檢測。但在實際操作過程中，需要注意的是：1)從組織(特別是實體組織)中獲得細(xì)胞的數(shù)量和活性;2) 在獲取過程中人為操作對細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的影響，以避免出現(xiàn)人為因素的轉(zhuǎn)錄表達(dá)變化。當(dāng)然從技術(shù)上說，除了分離單個細(xì)胞進(jìn)行檢測外，還可以直接分離細(xì)胞核(nuclei)進(jìn)行測序。

　　4. 單細(xì)胞測序的方法選擇?

　　總體上有大約20種protocol，各個protocol的比較如下圖所示：

　　我們可以看到轉(zhuǎn)錄本的長度包括了：全長(Full length)和3’端測序，需要注意的是對于表達(dá)量較低的RNA來說更建議全長測序。其它的信息還包括了測序的平臺(Droplet、Nanowell等)、測序通量(細(xì)胞的數(shù)量)、測序深度、反應(yīng)體系和參考文獻(xiàn)等。

　　5. 需要測定的細(xì)胞數(shù)量以及測序深度該如何確定?

　　總體上說，大家需要考慮的因素包括研究目的、細(xì)胞的異質(zhì)性大小、平臺和價格。一般來說，異質(zhì)性越高，我們需要檢測的細(xì)胞亞群比例越低，需要測定的細(xì)胞數(shù)量就越多，大家可以類比考慮，比如A袋子有5個紅球、5個藍(lán)球組成;B袋子有赤橙黃綠青藍(lán)紫7個顏色組成的10個球，其中我們關(guān)心的藍(lán)球只有1個，如果我們想抽到籃球，是不是要抽更多次B袋子?

　　6. 單細(xì)胞RNA測序與常規(guī)RNA測序的區(qū)別是什么?

　　主要有三點：

1) 單細(xì)胞測序中某些低風(fēng)度的轉(zhuǎn)錄本不能被檢測到;

2)單細(xì)胞測序比常規(guī)測序的會有更高的技術(shù)誤差(包括檢測噪音等);

3)單細(xì)胞測序檢測的轉(zhuǎn)錄本量的分布上更加復(fù)雜，一般是符合負(fù)二項分布的，但也出現(xiàn)其它的分布，因此在選擇統(tǒng)計方法時一定要特別注意。

　　7. 單細(xì)胞RNA測序的分析該如何做?

　　這一部分我們下次單獨寫一期文章來介紹。

　　8. 單細(xì)胞RNA測序未來5年的前景如何?

　　主要包括幾點：

　　1) 對檢測細(xì)胞(樣本)的要求降低：從新鮮細(xì)胞到冷凍保存的細(xì)胞;

　　2)性價比的提高：包括了平臺技術(shù)的進(jìn)步導(dǎo)致價格進(jìn)一步降低和檢測通量的增加：

　　3)對低豐度RNA檢測的問題;

　　4)新的生信工具和軟件的出現(xiàn)：后面我們會為大家介紹一個數(shù)據(jù)庫——SCPortalen，來看別人的單細(xì)胞測序技術(shù)數(shù)據(jù)的挖掘使用。

　　5)與其它技術(shù)的聯(lián)合：比如Crispr;

　　6)臨床應(yīng)用：按照這篇文章的觀點，單細(xì)胞測序往臨床上用的時間點大約在5年。